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2024年12月14日，高效液相色谱法-基础篇2023-07-14 08:50·生物科研实验中心摘要高效液相色谱法（HPLC）具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点，广泛应用于医药、环保、石化、食品、化工等行业，是现在分离分析的重要方法，本文着重介绍HPLC的工作原理、基本组成及高效液相色谱名词术语，使新学者快速了解高效液相色谱知识，在日常操作中理论与实践结合，确保HPLC的高效运行、快速分析。1、HPLC工作原理100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特) 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带，Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)。Tswett(茨维特)色谱实验色谱法是通过是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离，色谱法的本质是分离分析方法。色谱分离原理两相中的一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase)，一相是流动的，叫作流动相(Mobile Phase)，又叫洗脱剂。用液体作为流动相的，即为液相色谱(Liquid Chromatography, LC)。HPLC为High Performance Liquid Chromatography的缩写（High高、Performance性能、Liquid液体的、Performance 色谱），是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点。2、HPLC分类按固定相和流动相的相对极性分为正相色谱(NormalPhaseChromatography)和反相色谱(Reversed Phase Chromatography)。正想色谱：固定相的极性大于流动相。反相色谱：固定相的极性小于流动相。有机化合物极性是指分子间作用力(静电引力、偶极力、色散力、氢键力)综合表现的一种表述。相色谱法与反相色谱法比较表从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。按分离过程的机理分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和体积排除色谱。吸附色谱(Absorption Chromatography)：根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离。分配色谱(Partition Chromatography)：分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同。离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)：根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)。体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)：分为GPC和GFC。GPC(Gel Permeation Chromatography凝胶渗透色谱又称尺寸排阻色谱)：固定相是疏水性凝胶,流动相是水或缓冲溶液-有机溶剂。GFC(Gel Filtration Chromatography凝胶过滤色谱又称水系凝胶色谱)：固定相是亲水性凝胶,流动相是水或缓冲溶液。3、HPLC组成HPLC由溶剂输送系统（脱气机、高压泵等）、进样系统（定量泵、六通阀、定量环、进样针等）、分离系统（色谱柱等）、检测系统（检测器等）、记录及数据处理系统。高压输液泵：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统，具有有足够的压力，输出流量恒定、可调，输出压力平稳，泵室体积小，泵体抗腐蚀、耐酸等特点。压力平稳、流速恒定是HPLC系统稳定、重现性良好的前提条件，多数的HPLC故障、色谱数据异常均会表现出压力异常，如偏高、偏低、波动大等，在日常使用中需要特别关注压力变化。在线脱气机：四元低压系统属于泵前混合，由于在常压下混合，极易产生气泡，必须配有在线脱气机，并要求流动相使用前进行脱气，流动相脱气得目的如下：使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。提高保留时间和色谱峰面积的重现性。防止气泡引起尖峰。使基线稳定，提高信噪比。降低溶剂的紫外吸收本底。减少死体积。防止填料氧化。进样系统：分为手动进样系统和自动进样系统， 主要由定量环、六通阀、进样针等部件组成。手动进样系统的定量环用于准确定量，分为5μl、10μl、20μl等，需要根据不同进样量选择合适的定量环；自动进样系统仪器自带定量环多为100μl，如进样量大于定量环体积需咨询相应仪器工程师更换定量环及计量泵等，六通阀是最理想的进样部件，由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成，通过阀切换保证恒定的流速，下图为六通阀不同状态流路示意图。分析液相多数配自动进样系统，自动进样系统具有进样精度高、重现性好、可用于大量样品分析等特点。分离系统：包括色谱注、柱温箱，连接管线等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 μm高效微粒固定相，根据不同的实验需求需要选择不同填料、不同规格的色谱柱。柱温箱：保证分离系统的温度恒定，降低温度波动对色谱基线、保留时间及色谱分离的影响，包括普通柱温箱及带有冷却功能的柱温箱，普通柱温箱可以根据方法需求设定高于室温的温度（一般应高于室温5℃以上），降低柱压或是改善色谱分离，带有冷却功能的柱温箱可以升高柱温外,还可以设定低于室温的温度，预防稳定性差样品的降解，各品牌柱温箱的控温范围略有差别，需要通过相应产物说明书或咨询客服了解。需要特别注意的是有些品牌的柱温箱是没有配置预加热模块的，对于温度敏感的样品需要在柱前连接一段管线，对流动相进行预加热，管线长度及内径需适当，尽量降低死体积。检测器：包括紫外可见吸收检测器(UVD)、荧光检测器(FD)、蒸发光检测器（ELSD）、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ED)、化学发光检测器(CD)、质谱检测器（MS）等类型，其技术要求为灵敏度高、噪音低、线形范围宽、响应快。紫外可见吸收检测器(UVD)：波长范围190～800mm，190～400mm为紫外区域，氘灯，400～800mm为可见光区域，钨灯。其特点为灵敏度高，最小检测浓度10-9g/ml，线性范围宽，对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱，应用范围广。适用于带有共轭基团的化合物，为最常用的检测器。荧光检测器(FD)：氘灯作激发光源，波长范围250～600nm。其特点为灵敏度更高，检测限10-12～10-13g/ml（灵敏度比UV检测器高2～3个数量级），选择性好，对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱，所需试样量少，适于痕量分析，应用于组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。蒸发光检测器（ELSD）：是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。其主要缺点为响应值与浓度不呈线性，需取响应值的对数与浓度计算线性。示差折光检测器(RID)：是一种连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的通用型检测器，其优点为对糖类检测灵敏度较高，其检测限可达10-8g/ml；稳定性好，操作方便，缺点该检测器对多数物质的灵敏度低（约10-5g/ml）,通常不用于痕量分析；受环境温度、流动相组成等波动的影响较大，不适合梯度洗脱。质谱检测器（MS）:将样品中的分析物电离，不同质量离子在电场或磁场中，将按其质量和所带的电荷比（质荷比，m/z）进行的分离和排序，根据质荷比的大小和相对强度形成规则的质谱，从而对物质进行结构鉴别和定量分析。质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，但流动相中不能含有无机盐。4、HPLC名词术语色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间。色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号。峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线。峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离。峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值。基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号。基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化。基线噪声(N)N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动。谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰最大值所需的时间。死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间。保留体积(VR)(Retention volume):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积。死体积(V0)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积。等度：在整个运行过程中溶剂组成保持不变，如(60:40 甲醇/水)。梯度：在运行过程中溶剂组成变化，渐变或台阶式变化，如100%的 H20/ 0%的MeOH到0%的H2O/100%的MeOH。分离度：用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大1.5 ,分离度的计算实例如下图：理论塔板数(N):分离效率的量度，用于评价色谱柱的分离效能。拖尾因子：用于评价色谱峰的对称性。重复性：用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100和 120%的对照品溶液，加人规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。5、HPLC日常操作注意事项选择流动相时应注意的几个问题：尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有较强的紫外吸收，一般检测波长应大于流动相的截止波长。泵的维护保养：防止任何固体微粒进入泵体，否则会磨损柱塞、密封环缸体和单向阀，因此应预先对流动相进行过滤，可采用Millipore滤膜(0．22μm或 0．45μm )等过滤。泵的入口都应该连接砂滤棒(或片)， 输液泵的滤器应经常更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质， 含有缓冲液的流动相不应保留在泵内， 尤其是停泵过夜或更长时间。分析工作结束后必须用纯水充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合固定相，可以是甲醇或甲醇和水)泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、密封环或缸体，最终产生漏液。输液泵的工作压力不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。紫外检测器维护保养：流通池进入气泡会干扰基线，并极难排出，应使用充分脱气的流动相，以减少气泡的产生。应定期冲洗系统，避免流通池干涸。检测器中氘灯( 光源) 随着使用时间的增加，氘灯强度降低，噪音会不断增大，故分析前柱平衡得差不多时，再打开检测器，分析工作结束及时关闭检测器（频繁开关检测器也会缩短检测器寿命，一般开启间隔少于4小时，不建议关闭检测器）。尘埃在静电的作用下容易覆盖在光学元件上， 使光传播效率降低，增加了光散射， 影响分析效果， 因此检测器周围的环境应保持清洁。
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